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ICS 65.020.30 CCS B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 41185—2021 水生动物病原DNA检测参考物质制备和 质量控制规范 质粒 Specification of preparation and quality control of reference materials for DNA detection of aquatic animals pathogen-Plasmid 2022-07-01实施 2021-12-31发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T 41185—2021 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 本文件由中华人民共和国农业农村部提出。 本文件由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。 本文件起草单位:中国检验检疫科学研究院、北京海关、连云港海关 本文件主要起草人:林祥梅、张曼、王娜、吴绍强、景宏丽、谷强、任彤、周毅、江育林 SAG 1 GB/T 411852021 水生动物病原DNA检测参考物质制备和 质量控制规范质粒 1范围 本文件给出了作为水生动物病原DNA检测阳性参考物质的质粒,其质量控制规范术语和定义、缩 略语、原理、试剂或材料、仪器设备,规定了质粒制备的通用要求、质粒的质量控制、质粒的验证,以及质 粒的质量评价方法。 本文件适用于水生动物病原DNA核酸检测中质粒的制备和质量控制。 2规范性引用文件 2 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SC/T7019水生动物病原微生物实验室保存规范 SAC 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 变异系数coefficient of variation 概率分布离散程度的一个归一化量度,其定义为数据标准差与数据平均值之比 3.2 初始样 羊frontsample 按照制备先后顺序,最先制备的1/3批次产品 3.3 均匀性uniformity 同一生产批次的质粒,每支含有等量目的基因的状态。 3.4 潮源性 traceability 质粒中目的基因序列与病原参考毒株序列的一致性。 3.5 稳定性stability 质粒在特定保存条件和保存时间范围内,保证检测结果为阳性的能力。 3.6 阳性参考物质positive referencematerial 与病原拥有某些完全相同的特征,如相同的目的基因序列、抗原性、敏感性等,用于该病原检测一定 会得出理想的阳性检测结果,通常作为阳性对照判定待测样品是否为病原阳性 1 GB/T 41185—2021 3.7 中间样 middlesample 按照制备先后顺序,中间制备的1/3批次产品 3.8 终止样 finalsample 按照制备先后顺序,最后制备的1/3批次产品 3.9 最小有效取样量 minimumeffectivesamplevolume 使用病原检测方法,可检测出阳性结果的最小阳性参考物质的量。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Amp:氨苄青霉素(ampicillin) Ct:扩增循环数(cyclethreshold) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) dATP:三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(deoxyadenosinetriphosphate) dCTP:三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(deoxycytidinetriphosphate) dGTP:三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(deoxyguanosinetriphosphate) dNTP:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate) dTTP:三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(deoxythymidinetriphosphate) EB:漠化乙锭(ethidiumbromide) IPTG:异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) LB:营养肉汤(luria-bertanibroth) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) qPCR:实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitativereal-timepolymerasechainreaction) Taq:水生嗜热菌(Thermus aquaticus) 5原理 利用基因重组技术,将目的DNA片段连接人空质粒中,再将连接产物转化入感受态细胞,筛选出 含有阳性重组质粒的细胞,再从细胞中提取质粒,制备流程按照附录A进行。为满足病原分子生物学 检测要求,作为DNA参考物质的质粒应具备以下特征:包含有针对检测病原的目的DNA片段;不易降 解,不会丢失病原DNA片段;易于大量制备提纯;可用于病原定性或定量检测 6试剂或材料 6.1水:符合GB/T6682中一级水规定 6.2PCR试剂和qPCR试剂:商品化试剂。 6.3扩增病原目的基因的引物:可参照相应的国家标准或行业标准合成。 6.4琼脂糖:电泳纯。 2
GB-T 41185-2021 水生动物病原DNA检测参考物质制备和质量控制规范 质粒
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